DELETERIOUS EFFECT OF VICILINS FRACTIONS FROM LEGUMINOUS SEED IN SEMI-FIELD CONDITIONS FOR Ceratitis capitata

Autores

DOI:

https://doi.org/10.15628/holos.2021.12213

Palavras-chave:

Vicilin, Bioinsecticide, Ceratitis capitata

Resumo

Fruitful food products are controlled by phytosanitary regulation mechanisms. Among the existing pests of economic interest, Cetatitis capitata, which can infest 250 to 400 plant varieties. Vicilins, seed-forming proteins, chitin-binding, are potentially candidates for fighting this pest. Vicilin-rich fractions of Erythrina velutina, Canavalia ensiformis and Phaseoulus vulgaris, isolated on chitin column affinity chromatography were tested in adults of C. capitata, in laboratory and semi-field bioassays. All linked chitin, have acidic characteristics and are associated with carbohydrates. Vicilin of E. velutina was the only one to present a high lethality (100%) in diet in 15% (w/w). In semi-field it was observed that 10 and 15% (w/w) of vicilin added to the diet were lethal. For TL50, death of half the population in days, was 3.5 (10%) and 3 (15%). These results showed that vicilins are potential bioinsecticides in the control of C. capitata.

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Biografia do Autor

Cleysyvan de Sousa Macedo, Instituto Federal de Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte, Campus Caicó – RN, Brasil.

Graduação em Ciências Biológicas e Mestrado pelo programa de Pós-graduação em Bioquímica e Biologia Molecular, ambos pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. Atualmente professor no Instituto Federal de Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte, Campus Caicó – RN, Brasil.

Anderson Felipe Jácome de França, Secretaria de Educação e Cultura: Natal, Rio Grande do Norte, Brasil. Escola Multicampi de Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Caicó – RN, Brasil.

Graduação em Ciências Biológicas e Doutorado pelo programa de Pós-graduação em Bioquímica e Biologia Molecular, ambos pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. Atualmente professor efetivo da Secretaria de Educação e Cultura: Natal, Rio Grande do Norte, Brasil e professor colaborador voluntário na Escola Multicampi de Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Caicó – RN, Brazil.

 

Leonardo Lima Pepino Macedo, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária: Brasilia, DF, Brasil.

Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte (2005). O curso de Mestrado em Bioquímica foi realizado na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (2007). Com doutorado concluído pelo programa de Ciência Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília (2012). Tem experiência em Bioquímica e Biologia Molecular. Atuando nos seguintes temas: Clonagem e expressão de proteínas em sistemas heterólogos; Bioprospecção de proteínas com atividade entomotóxicas (vicilinas, lectinas, inibidores de proteinases e toxinas Cry) visando o controle de insetos dípteros, lepidópteros e coleópteros; e desenvolvimento de estratégias de silenciamento gênico via RNA interferente (RNAi) para o controle de insetos-praga.

Ticiana Maria Lúcio de Amorim, Curso de Bacharelado em Medicina- Núcleo de Pesquisa em Ciências Médicas/NPCMed, Universidade Federal do Piauí, Picos - PI, Brasil.

Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual da Paraíba (2004). Mestrado em Bioquímica pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Doutorado em Bioquímica, com áreas de concentração em Bioquímica e Biologia Molecular, também pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte, realizando pesquisas relacionadas à aplicação de inibidores recombinantes em processos de importância para a saúde humana. Atualmete professora no curso de bacharelado em Medicina- Núcleo de Pesquisa em Ciências Médicas/NPCMed, Universidade Federal do Piauí, Picos - PI, Brasil.

Raphael Russi de Oliveira Araújo, Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil.

Bacharel em Biomedicina, formado pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Experiência na área de Bioquímica, com ênfase em Química de Macromoléculas Bioativas. Aluno de mestrado do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Celular (PPG/DBq), trabalhando com imunoematologia, inflamação e câncer.

Yago Queiroz dos Santos, Instituto Federal do Ceará, Campus Limoeiro do Norte, Limoeiro do Norte - CE, Brasil.

Possui graduação em Ciências Biológicas (2014) pela Universidade Federal da Paraíba, mestrado (2016) e doutorado (2020) em Bioquímica e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN. Atualmente desenvolve pesquisas no Laboratório Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB), do Depto. de Bioquímica da UFRN e no Laboratório de Microbiologia do Instituto de Medicina Tropical (IMT-UFRN). Possui experiência nas áreas de Bioquímica e Genética de Microrganismos, com especial foco no isolamento e caracterização de enzimas, identificação molecular de microrganismos e determinação da atividade antibacteriana de moléculas bioativas. Possui graduação em andamento no curso de Direito na Universidade Federal do Rio Grande do Norte, atuando na área de Direito Constitucional (Teoria Geral dos Direitos Fundamentais). É professor efetivo do Instituto Federal do Ceará.

Gabriella Silva Campos Carelli, Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.

Mestranda em Bioquimica e Biologia Molecular do programa de pós-graduação em Bioquímica (PPGBIOQ) da Universidade Federal do Rio Greande do Norte, graduada em Ciências Biológicas (2019) pela (UFRN). Possui formação em Técnico de Enfermagem (2015) pela UFRN. Atualmente desenvolve pesquisas no Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas (LQFPB) no departamento de bioquímica da UFRN e no Laboratório de microbiologia (LMAC) do Instituto de Medicina Tropical (IMT-UFRN).

Adriana Ferreira Uchoa, Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil.

Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Ceará (1997), mestrado em Biociências e Biotecnologia pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (2000) e doutorado em Biociências e Biotecnologia pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (2006). Atualmente é professora associado II do Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Pesquisadora do Instituto de Medicina Tropical do RN (UFRN). Tem experiência na área de Bioquímica, com ênfase em Química de Proteínas, atuando principalmente nos seguintes temas: Extratos vegetais e Proteínas bioativas, atividade bioinseticida, fungicida e nematicida; inibidores de proteases, proteínas de ligação a quitina do tipo vicilinas, prospecção de atividades biológicas de moléculas bioativas de sementes e proteoma.

Francisco Pepino De Macedo, Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil.

Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte (1976) e doutorado em Ciências Biológicas (Biologia Genética) pela Universidade de São Paulo (1998). Atualmente é Professor Titular da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Desenvolve atividades nas áreas de Genética e Entomologia Agrícola. (Texto informado pelo autor)


Adeliana Silva de Oliveira, Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.

Possui graduação em Ciências Biologicas pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte(1993), especialização em Bioquímica da Nutrição pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte(1994), mestrado em Bioquímica pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte(2000), doutorado em Bioquímica pela Universidade Federal do Ceará(2007) e pós-doutorado pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte(2013). Atualmente é Revisor de periódico da Comitê Local de Publicações da Embrapa Algodão. Tem experiência na área de Bioquímica, com ênfase em Química de Macromoléculas. Atuando principalmente nos seguintes temas:inibidor de tripsina, Pithecellobium dumosum, Insetos pragas.

Elizeu Antunes dos Santos, Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.

Professor Titular da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Graduado em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte (1987), Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Molecular) pela Universidade Federal de São Paulo (1990) e Doutor em Ciências Biológicas (Biologia Molecular) pela Universidade Federal de São Paulo (1997). Tem experiência na área de Bioquímica, com ênfase em Química de Proteínas e Glicobiologia (Lectinas e Glicosaminoglicanos), atuando principalmente nos seguintes temas: lectinas, inibidores proteicos de proteinases, enzimas, heparina, glicosaminoglicanos, organismos invertebrados, mollusca, porifera, fungos, bactérias e leguminosas. É orientador de mestrado e doutorado no Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da UFRN. Atua, ainda, em atividades pedagógicas de formação do Ensino Superior (presencial e a distância) e na formação de professores do Ensino Básico. Atual vice-coordenador do curso de Ciências Biológicas a distância (SEDIS-UFRN). Cargos já exercidos na UFRN: Chefia do Departamento de Bioquímica; Coordenador do curso de Ciências Biológicas; membro do Conselho Superior de Ensino, Pesquisa e Extensão; Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica (mestrado e doutorado).

Jonalson Nogueira de Araujo, Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.

Possuo graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal da Rio Grande do Norte, mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN.

Referências

Amorim, T. M. L., Macedo, L. L. P., Uchoa, A. F., Oliveira, A. S., Pitanga, J. C. M., Macedo, F. P., Santos, E. A., & De Sales, M. P. (2008). Proteolytic digestive enzymes and peritrophic membranes during the development of Plodia interpunctella (Lepidoptera: Piralidae): Targets for the action of Soybean Trypsin Inhibitor (SBTI) and Chitin-Binding Vicilin (EvV). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(17), 7738–7745. https://doi.org/10.1021/jf801224d DOI: https://doi.org/10.1021/jf801224d

Bore, E., Hébraud, M., Chafsey, I., Chambon, C., Skjæret, C., Moen, B., Møretrø, T., Langsrud, Ø., Rudi, K., & Langsrud, S. (2007). Adapted tolerance to benzalkonium chloride in Escherichia coli K-12 studied by transcriptome and proteome analyses. Microbiology, 153(4), 935–946. https://doi.org/10.1099/mic.0.29288-0 DOI: https://doi.org/10.1099/mic.0.29288-0

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(8), 248–254. https://doi.org/10.1088/1751-8113/44/8/085201 DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3

Cândido, E. D. S., Pinto, M. F. S., Pelegrini, P. B., Lima, T. B., Silva, O. N., Pogue, R., Grossi-de-Sá, M. F., & Franco, O. L. (2011). Plant storage proteins with antimicrobial activity: novel insights into plant defense mechanisms. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 25(10), 3290–3305. https://doi.org/10.1096/fj.11-184291 DOI: https://doi.org/10.1096/fj.11-184291

Coelho, M. B., Macedo, M. L. R., Marangoni, S., Da Silva, D. S., Cesarino, I., & Mazzafera, P. (2010). Purification of legumin-like proteins from coffea arabica and coffea racemosa seeds and their insecticidal properties toward cowpea weevil (Callosobruchus maculatus) (Coleoptera: Bruchidae). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(5), 3050–3055. https://doi.org/10.1021/jf9037216 DOI: https://doi.org/10.1021/jf9037216

Derbyshire, E., Wright, D. J., & Boulter, D. (1976). Legumin and vicilin, storage proteins of legume seeds. In Phytochemistry (Vol. 15, Issue 1, pp. 3–24). Pergamon. https://doi.org/10.1016/S0031-9422(00)89046-9 DOI: https://doi.org/10.1016/S0031-9422(00)89046-9

FAO. (2020). FOOD SECURITY AND NUTRITION IN THE WORLD THE STATE OF TRANSFORMING FOOD SYSTEMS FOR AFFORDABLE HEALTHY DIETS. https://doi.org/10.4060/ca9692en DOI: https://doi.org/10.4060/ca9692en

FAOSTAT. (2020). http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC

França, A. F. J., Araújo, J. N., Santos, Y. Q., Carelli, G. S. C., Silva, D. A., Amorim, T. M. L., Migliolo, L., Santos, E. A., Oliveira, A. S., & Uchôa, A. F. (2021). Vicilin from Anadenanthera colubrina Seeds: An alternative tool to combat Callosobruchus maculatus. Saudi Journal of Biological Sciences, xxxx, 1–9. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2021.05.041 DOI: https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2021.05.041

Gerum, Á. F. A. de A. (2019). Fruticultura Tropical: potenciais riscos e seus impactos. EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, 28. https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/197322/1/Documento232-AureaGerum-Ainfo.pdf

Hegedus, D., Erlandson, M., Gillott, C., & Toprak, U. (2009). New Insights into Peritrophic Matrix Synthesis, Architecture, and Function. Annual Review of Entomology, 54(1), 285–302. https://doi.org/10.1146/annurev.ento.54.110807.090559 DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.ento.54.110807.090559

Hung, H.-C., Joshipura, K. J., Jiang, R., Hu, F. B., Hunter, D., Smith-Warner, S. A., Colditz, G. A., Rosner, B., Spiegelman, D., & Willett, W. C. (2004). Fruit and Vegetable Intake and Risk of Major Chronic Disease. JNCI Journal of the National Cancer Institute, 96(21), 1577–1584. https://doi.org/10.1093/jnci/djh296 DOI: https://doi.org/10.1093/jnci/djh296

Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0 DOI: https://doi.org/10.1038/227680a0

Macedo, L. L. P., Amorim, T. M. L., Uchôa, A. F., Oliveira, A. S., Ribeiro, J. K. C., De MacEdo, F. P., Santos, E. A., & De Sales, M. P. (2008). Larvicidal effects of a chitin-binding vicilin from erythrina velutina seeds on the mediterranean fruit fly ceratitis capitata. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(3), 802–808. https://doi.org/10.1021/jf072746n DOI: https://doi.org/10.1021/jf072746n

Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., & Lee, Y. C. (2005). Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry, 339(1), 69–72. https://doi.org/10.1016/j.ab.2004.12.001 DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2004.12.001

Miranda, M. R. A., Uchôa, A. F., Ferreira, S. R., Ventury, K. E., Costa, E. P., Carmo, P. R. L., Machado, O. L. T., Fernandes, K. V. S., & Amancio Oliveira, A. E. (2020). Chemical Modifications of Vicilins Interfere with Chitin-Binding Affinity and Toxicity to Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Chrysomelidae) Insect: A Combined in Vitro and in Silico Analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 68(20), 5596–5605. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b08034 DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b08034

Moazzen, S., van der Sloot, K. J. W., Bock, G. H. d., & Alizadeh, B. Z. (2020). Systematic review and meta-analysis of diet quality and colorectal cancer risk: is the evidence of sufficient quality to develop recommendations? In Critical Reviews in Food Science and Nutrition. Taylor and Francis Inc. https://doi.org/10.1080/10408398.2020.1786353 DOI: https://doi.org/10.1080/10408398.2020.1786353

Mota, A. C., DaMatta, R. A., Filho, M. L., Silva, C. P., & Xavier-Filho, J. (2003). Cowpea (Vigna unguiculata) vicilins bind to the peritrophic membrane of larval sugarcane stalk borer (Diatraea saccharalis). Journal of Insect Physiology, 49(9), 873–880. https://doi.org/10.1016/S0022-1910(03)00139-2 DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-1910(03)00139-2

Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., & Ehrhardt, W. (1988). Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G?250 and R?250. ELECTROPHORESIS, 9(6), 255–262. https://doi.org/10.1002/elps.1150090603 DOI: https://doi.org/10.1002/elps.1150090603

Nishida, T. (1980). Food System of Tephritid Fruit Flies in Hawaii. Proc Hawaiian Entomol Soc, 23(2), 245–254. http://hdl.handle.net/10125/11110

Oliveira, C. M., Auad, A. M., Mendes, S. M., & Frizzas, M. R. (2013). Economic impact of exotic insect pests in Brazilian agriculture. In Journal of Applied Entomology (Vol. 137, Issues 1–2, pp. 1–15). John Wiley & Sons, Ltd. https://doi.org/10.1111/jen.12018 DOI: https://doi.org/10.1111/jen.12018

Paes, E. V., Uchôa, A. F., Pinto, M. S. T., Silva, C. P., Fernandes, K. V. S., Oliveira, A. E. A., & Xavier-Filho, J. (2008). Binding of Vigna unguiculata vicilins to the peritrophic membrane of Tenebrio molitor affects larval development. Entomologia Experimentalis et Applicata, 129(1), 11–17. https://doi.org/10.1111/j.1570-7458.2008.00746.x DOI: https://doi.org/10.1111/j.1570-7458.2008.00746.x

Qin, Y., Paini, D. R., Wang, C., Fang, Y., & Li, Z. (2015). Global establishment risk of economically important fruit fly species (Tephritidae). PLoS ONE, 10(1), e0116424. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0116424 DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0116424

Sales, M. P., Gomes, V. M., Fernandas, K. V. S., & Xavier-Filho, J. (1996). Chitin-binding proteins from cowpea (Vigna unguiculata) seeds. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 29(3), 319–326. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8736124

Santos, Y. Q. dos, Carelli, G. S. C., Veras, B. O. de, Batista, V. C., França, A. F. J. de, Silva, M. V. da, & Santos, E. A. dos. (2019). Antitryptical, anticoagulant and hemagglutinating activities of Eucalyptus sp. seeds. F1000Research, 8, 28. https://doi.org/10.12688/F1000RESEARCH.17080.1 DOI: https://doi.org/10.12688/f1000research.17080.1

Shewry, P. R., & Lucas, J. A. (1997). Plant Proteins that Confer Resistance to Pests and Pathogens. Advances in Botanical Research, 26(C), 135–192. https://doi.org/10.1016/S0065-2296(08)60120-2 DOI: https://doi.org/10.1016/S0065-2296(08)60120-2

Sobrinho, R. B., Malavasi, A., Mesquita, A. L. M., & Ometo, A. C. F. (2001). Manual operacional para monitoramento e controle de moscas-das-frutas (1st ed.). Embrapa Agroindústria Tropical. https://www.embrapa.br/agroindustria-tropical/busca-de-publicacoes/-/publicacao/423835/manual-operacional-para-levantamento-deteccao-monitoramento-e-controle-de-moscas-das-frutas

Stuhl, C., Sivinski, J., Teal, P., Paranhos, B., & Aluja, M. (2011). A Compound Produced by Fruigivorous Tephritidae (Diptera) Larvae Promotes Oviposition Behavior by the Biological Control Agent Diachasmimorpha longicaudata (Hymenoptera: Braconidae). Environmental Entomology, 40(3), 727–736. https://doi.org/10.1603/en10198 DOI: https://doi.org/10.1603/EN10198

Terra, W. R. (2001). The origin and functions of the insect peritrophic membrane and peritrophic gel. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 47(2), 47–61. https://doi.org/10.1002/arch.1036 DOI: https://doi.org/10.1002/arch.1036

White, I. M., & Elson-Harris, M. M. (1992). Fruit flies of economic significance: their identification and bionomics. In CAB International, Wallingford, Oxon (p. 601). https://doi.org/https://doi.org/http://dx.doi.org/10.1093/ee/22.6.1408 DOI: https://doi.org/10.1079/9780851987903.0000

Xavier-Filho, J., Campos, F. a. P., Ary, M. B., Silva, C. P., Carvalho, M. M. M., Macedo, M. L. R., Lemos, F. J. a., & Grant, G. (1989). Poor correlation between the levels of proteinase inhibitors found in seeds of different cultivars of cowpea (Vigna unguiculata) and the resistance/susceptibility to predation by Callosobruchus maculatus. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 37(4), 1139–1143. https://doi.org/10.1021/jf00088a071 DOI: https://doi.org/10.1021/jf00088a071

Yunes, A. N. A., de Andrade, M. T., Sales, M. P., Morais, R. A., Fernandes, K. V. S., Gomes, V. M., & Xavier-Filho, J. (1998). Legume seed vicilins (7S storage proteins) interfere with the development of the cowpea weevil (Callosobruchus maculatus (F)). Journal of the Science of Food and Agriculture, 76(1), 111–116. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0010(199801)76:1<111::aid-jsfa932>3.0.co;2-4 DOI: https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0010(199801)76:1<111::AID-JSFA932>3.0.CO;2-4

Zhihong, L., Fan, J., Xingli, M., Yan, F., Zhuangzhi, S., Yujia, Q., & Qiaoling, W. (2013). Review on prevention and control techniques of Tephritidae invasion. Plant Quarantine, 02. http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-ZWJY201302001.htm

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08/12/2021

Como Citar

Macedo, C. de S., França, A. F. J. de, Macedo, L. L. P., Amorim, T. M. L. de, Araújo, R. R. de O., Santos, Y. Q. dos, … Araujo, J. N. de. (2021). DELETERIOUS EFFECT OF VICILINS FRACTIONS FROM LEGUMINOUS SEED IN SEMI-FIELD CONDITIONS FOR Ceratitis capitata. HOLOS, 8, 1–17. https://doi.org/10.15628/holos.2021.12213

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